多重PCR技術用於食源性金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測

　　材料與方法

　　菌株來源 145株金黃色葡萄球菌從食物檢測樣本中提取，其中食源性致病菌檢測樣本110株，包括熟肉、速凍製品、涼拌菜、沙拉、果汁等;食物中毒樣本35株，從患者剩餘食物、糞便、肛拭子中獲得。

　　儀器試劑 Baird-Parker瓊脂培養基、血平板、亞碲酸鉀卵黃增菌液，均由北京陸橋技術股份有限公司提供;溶菌酶、基因組提取試劑盒、PCR引物，由上海生工生物工程公司提供;細菌培養箱是由德國賓德公司提供;基因擴增儀、毛細管電泳儀、微量分光光度計等，是由美國IBM公司提供。

　　方法 菌株複蘇:在菌株磁珠凍存管中，用接種環挑取1顆磁珠，放於營養瓊脂肉湯中，在37℃溫度下培養24小時，並觀察其渾濁度。基因提取:取混濁菌液1ml放在1.5ml的EP管內，10000rpm離心3min。除去上層清液，向沉澱物加入200μl溶菌酶溶液(濃度為50mg/ml)，混合均勻後，在37℃條件下靜置1小時。然後按照DNA提取試劑盒上的說明提取DNA，用微量分光光度計，測定提取DNA的濃度，加純水直至濃度達到10ng/μl，並保存在-20℃的環境中。引物設計和片段測序:參考GenBank數據庫、應用Primer remier分析軟件，分別對9種腸毒素基因的PCR引物進行篩選和設計，見下表1。

　　單重PCR反應體係:Multiplex PCR Mix2 25μl，上遊引物、下遊引物均為0.5μl;Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入純水直至50μl。擴增條件：94℃條件下預熱2min，94℃30s、54℃60s、72℃80s，共計35個循環;最後72℃延伸8min。經毛細管電泳處理後，對PCR產物進行測序。多重PCR反應體係:對退火溫度、引物濃度等進行調節，優化單重PCR反應體係如下：Multiplex PCR Mix2 25μl，上遊引物、下遊引物均為0.4μl;Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入純水直至50μl。擴增條件設置如下：94℃條件下預熱2min;然後分別94℃30s、50℃60s、72℃80s，經過35個循環;最後72℃條件下延伸8min。對PCR產物進行毛細管電泳處理，觀察結果。

　　結果

　　引物特征性驗證結果。采用盲篩法，選擇9株毛細管電泳結果出現的目的片段菌株，對PCR產物測序後，和GenBank數據庫進行比對。結果顯示產物片段相似度高，滿足研究需求。見表2。

　　多重PCR檢測結果。利用多重PCR體係，對145株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因進行檢測，結果顯示97株(66.9%)至少含有1種腸毒素基因，48株(33.1%)含有2種及以上腸毒素基因。其中，9種腸毒素基因的檢出率從高到低依次為：SEU37株(25.5%)、SEG32株(22.1%)、SEM30株(20.7%)、SEK29株(20.0%)、SEQ26株(17.9%)、SEH23株(15.8%)、SEN15株(10.3%)、SEJ12株(8.3%)、SEL6株(4.1%)。金黃色葡萄球菌屬於葡萄球菌的一種，是造成食物中毒的重要原因之一，美國疾控中心的調查數據顯示，該菌株造成的食物中毒占比約為33%，僅次於大腸埃希氏菌，位居第二。對金葡的研究發現，其包含多種致病因子，例如腸毒素、殺白細胞素、溶血素、血漿凝固酶等，其中腸毒素的作用最為明顯。腸毒素是低分子蛋白和多肽，具有較強的耐熱性，即使在70-80℃條件下，30min以內蛋白不會完全破壞，而且也不會被胰蛋白酶降解。針對已知的腸毒素種類，采用有效的、特異檢測手段，能明確食物中毒的發生機製，為臨床診療提供依據。

　　本次研究中，以SEG、SHE、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEQ、SEU 9種腸毒素為研究對象，建立了多重PCR檢測體係，具有操作簡單、通量高、特異性高的優點。結果顯示，9種腸毒素均有檢出，以SEU、SEG、SEM、SEK的檢出率高。另外，相關研究指出，SEK和SEQ之間，SEM和SEN之間，SEG和SEU之間，均存在連鎖關係。以SEK和SEQ為例，兩者位於同一株金葡菌上，可能會對金葡菌的毒性力度產生影響，有待進一步研究。

　　綜上，多重PCR技術用於食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因檢測，準確性和特異性高，具有良好的應用價值。

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