1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　腰果為從某大型超市中購置的普通腰果，並將其在0～4℃環境下貯藏。

　　所用試劑均為國產分析純。

　　1.2儀器與設備

　　DHG-9143BS-III型電熱恒溫鼓風幹燥箱——上海新苗醫療器械製造有限公司;SX-5-12型箱式電阻爐——天津市泰斯特儀器有限公司;KDN-DI型自動定氮儀——上海新嘉電子有限公司;UV-1801型紫外可見分光光度計——北京瑞利分析儀器有限公司;SC-3610型低速離心機——安徽中科中佳科學儀器有限公司;HSJ係列數顯恒溫水浴鍋——金壇市科析儀器有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1原料營養成分的測定

　　水分含量測定：采用常壓幹燥法，GB/T5009.3—2010《食品中水分的測定》;灰分含量測定：采用灼燒法，GB/T5009.4—2010《食品中灰分的測定》;蛋白質含量測定：采用凱氏定氮法，GB/T5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》;粗脂肪含量測定：采用索氏提取法，GB/T14772—2008《食品中粗脂肪的測定》;膳食纖維含量測定：采用酶重量法，GB 5009.88-2014;碳水化合物含量測定：采用《預包裝食品營養標簽通則》(GB 28050-2011)問答(修訂版)的方法。

　　1.3.2蛋白質含量的測定

　　蛋白質的具體含量測定：使用考馬斯亮藍Bradford法，將牛血清蛋白作為標準的蛋白，運用考馬斯亮藍G-250染色，其得到的標準曲線方程為：Y=0.0046X-0.0125，R2=0.9964。運用以下公式對腰果蛋白提取率進行計算。

　　1.3.3原料處理及蛋白提取

　　1.3.3.1原料預處理

　　將腰果仁在粉碎機中粉碎處理，放置在幹燥器中幹燥，使用石油醚脫脂[2]，最終得到腰果粉。

　　1.3.3.2

　　腰果蛋白質的具體提取方法涉及到以下三種：

　　①Tris-HCl法[1]：取用脫脂後的腰果粉1g，在其中加入50mL 0.2mol/L pH 8的Tris-HCl緩衝液，在45℃的溫度條件下攪拌浸提6h，在4000r/min條件下離心15min，最終取上清液測定蛋白質含量。

　　②鹽溶法：取用脫脂處理後的腰果1g，向其中加入50mL 0.14mol/L的NaCl溶液，放置在45℃的溫度條件下攪拌浸提6h，在4000r/min轉速下條件下離心15min，最終取上清液測定蛋白質含量。

　　③堿溶酸沉法：選用脫脂後的腰果粉樣1g，向其中加入50mL的蒸餾水，用0.01mol/L的NaOH溶液調pH值至10，將其放置在45℃條件下攪拌浸提6h，在4000r/min條件下離心15min，最終取上清液測定蛋白質含量。

　　1.3.4蛋白質提取工藝的確定

　　1.3.4.1單因素試驗設計

　　最終確定使用堿提法，在相關條件達到一定時，其料液比則使用1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)這6個水平層次，0.01mol/L的NaOH溶液調節提取液pH值7、8、9、10、11、12共6個水平，提取溫度采用25、30、35、40、45、50℃共計6個水平，提取時間采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h共5個水平，來分別進行相應的單因素試驗。

　　1.3.4.2正交試驗設計

　　根據單因素試驗結果，選擇料液比、提取液pH值、提取溫度、提取時間進行四因素三水平L9(43)正交試驗，試驗設計見表1。

　　表1 正交試驗因素與水平

　　水平 因素

　　料液比(g/mL) pH 提取溫度/℃ 提取時間/h

　　1 1:30 7 30 1.0

　　2 1:40 8 35 1.5

　　3 1:50 9 40 2.0

　　2結果與分析

　　2.1腰果原料基本成分分析

　　從表2上，能夠明顯看出的是，粗脂肪含量是腰果仁成分含量占比最高的，達到44.13%，碳水化合物則為27.22%，蛋白質為19.41%。

　　表2 腰果原料基本成分分析

　　成分 粗脂肪 蛋白質 膳食纖維 碳水化合物 水分 灰分

　　含量/% 44.13 19.41 3.72 27.22 3.07 2.45

　　2.2提取方法的選擇

　　從以往的實驗來看，在腰果蛋白提取方法選擇上，不同的提取方法，提取率也有所差異：堿溶法相比於鹽溶法和Tris-HCl法，所呈現出的蛋白質提取率更為顯著，提取率為40.09%(P<0.05)，鹽溶法提取率最低，為20.15%。因此，本文實驗采取了堿提法。大量研究證明，堿能夠讓腰果的結構變得更為疏鬆，從而有效的打破了大分子間的部分氫鍵，並提高了蛋白溶解度，促使其提取率得到提高。

　　2.3單因素試驗

　　2.3.1料液比對腰果蛋白質提取率的影響

　　從實驗來看，當選取溫度為45℃、時間1h、pH9的情況下，將料液比作為變量進行3次平行試驗後，料液比從1:10～1:40(g/mL)的過程中，其蛋白質提取率有了明顯的上升趨勢。而料液比在1:40(g/mL)的情況下，其提取率得到顯著提升，最大達到56.32%(P<0.05)。

　　伴隨著提取液使用量的不斷提升，提取率開始不斷下降，降低為33.05%。導致這一結果的原因，可能在於溶液體積不斷增大、溶劑增加，原料中的內外蛋白質濃度差也開始提高，蛋白質也就越容易滲入到提取液中，提取率也得到了相應增大。而當提取液使用量不斷增長時，蛋白質溶液開始出現飽和，加水量過多，酸沉過程中上清液所殘留的清蛋白量明顯提升，蛋白質的損失量開始出現提高，反而使得提取率下降。故此，選擇料液比應當為1:40(g/mL)。

　　2.3.2 pH值對腰果蛋白質提取率的影響

　　當選取的料液比為1∶40(mg/mL)、溫度45℃、時間1h時，將pH值作為變量來進行3次平行試驗。從結果來看，提取液pH值從7上升到10的情況下，腰果蛋白質提取率會伴隨著pH值的提升而不斷提升，最高能夠達到53.25%(P<0.10)，而隨著pH值的不斷提升，其提取率便開始出現下降。這主要是由於堿本身能夠讓腰果結構變得更為疏鬆，打破了蛋白質分子之間的部分氫鍵，以此使得蛋白質與澱粉發生分離，從而提升了蛋白質提取率，而伴隨著pH值持續增大，蛋白質在強堿環境下更容易出現水解、變性，過程中蛋白質的顏色也會變深，如若蛋白質長時間受到強堿影響，則會發生“胱賴”反應，並生成有毒化合物。故此，實驗的pH值最佳範圍在9-10左右。

　　2.3.3提取溫度對腰果蛋白質提取率的影響

　　當選取料液比為1:40(mg/mL)、pH9、時間1h時，將溫度作為變量進行3次平行實驗。結果發現，不同提取溫度，對於蛋白質提取率影響顯著。當提取溫度在25～35℃範圍時，提取率開始不斷上升，從56.00%上升至61.07%，而伴隨著溫度變量的持續提高，提取率開始降低到54.73%。其原因在於35℃前，溫度上升的同時，親水基團逐漸展開，巰基含量得到提升，蛋白質溶解度持續升高;而隨著溫度的不斷上升，疏水基團被展開、暴露，導致蛋白質分子出現聚集，溶解度明顯下降，從而影響到提取率的下滑。而當溫度上升到一定範圍，蛋白質還可以發生變性。故此，實驗提取溫度範圍應當在35℃左右。

　　2.3.4提取時間對腰果蛋白質提取率的影響

　　當選取1:40(mg/mL)、溫度45℃、pH9的情況下，將浸提時間作為變量來進行3次平行試驗。從結果來看，在1.5h前，腰果蛋白提取率會伴隨著時間的不斷延長而持續提升，從48.27%上升到63.93%(P<0.05)，而在1.5h之後，提取率便開始出現了下降趨勢，下降到55.47%。這主要是由於去脂腰果粉本就需要耗費一定溶脹時間，在充足的溶脹時間下，才有利於蛋白質的分離溶解，但如果提取時間過長，浸提液中的已溶蛋白質出現了飽和現象，開始隨著疏水基團的暴露，蛋白質出現凝聚沉澱現象，從而促使提取率開始降低。

　　2.4腰果蛋白質提取條件優化

　　在單因素試驗基礎上做正交試驗，優化提取工藝。正交試驗結果見表3。

　　表3 腰果蛋白提取條件優化的正交試驗結果

　　試驗號 A B C D 蛋白質提取率/%

　　1 1 1 1 1 58.50

　　2 1 2 2 2 70.77

　　3 1 3 3 3 73.27

　　4 2 1 2 3 69.74

　　5 2 2 3 1 71.75

　　6 2 3 1 2 78.51

　　7 3 1 3 2 59.36

　　8 3 2 1 3 65.48

　　9 3 3 2 1 70.63

　　K1 67.51 62.53 67.50 66.76

　　K2 73.13 69.13 70.38 69.55

　　K3 65.16 74.14 67.93 69.50

　　R 7.98 11.60 2.88 2.79

　　表4 正交試驗結果方差分析表

　　因素 偏差平方和 自由度 F值 F0.05 F0.01 顯著性

　　A 100.77 2 10.23 19 99.00

　　B 203.23 2 20.61 19.00 99.00 *

　　C 14.62 2 1.47 19.00 99.00

　　D 15.26 2 1.55 19.00 99.00

　　誤差 9.85 2

　　注：*.差異顯著(P<0.05)。

　　選取料液比(A)、提取液pH值(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)4個因素，以腰果蛋白的提取率為指標，得出優化條件。從表3極差R值可以得出，對腰果蛋白提取率影響因素由大到小依次是B>A>C>D，即pH值對腰果蛋白的提取率影響最大。可以得出，最佳工藝條件為A2B3C2D2，即料液比1:40(g/mL)、提取液pH9、提取溫度35℃、提取時間1.5h。由表4方差分析結果表明：pH值為影響腰果蛋白質提取過程的顯著因素，料液比、提取時間、提取溫度為不顯著因素。根據最佳工藝條件對腰果蛋白進行提取，測得腰果蛋白的提取率可達79.0%。

　　使用最佳的提取方法堿提法，利用單因素、正交試驗得出腰果蛋白提取的最佳工藝條件是：料液比1:40(g/mL)、提取液pH9、提取溫度35℃、提取時間1.5h，在此條件下所得到的腰果蛋白提取率能夠達到79.0%。

　　參考文獻

　　[1]葉婧,曾育蒙,王秀麗,李建平. 腰果蛋白的提取及功能特性研究[J]. 食品研究與開發,2016,06:43-49.

　　[2]殷賀中. 不同種脫脂榛子粉、榛子蛋白粉理化性質比較研究[D].河南農業大學,2013.

　　胡蓉 江蘇省生產力促進中心理化測試中心